NPAS4 背景簡介：

神經(jīng)元活性參與信號(hào)通路，產(chǎn)生基因表達(dá)的改變，導(dǎo)致神經(jīng)元的長期適應(yīng)性變化，這種變化是行為可塑性的基礎(chǔ)。自從30多年前發(fā)現(xiàn)去極化作用可以驅(qū)動(dòng)C-Fos基因的轉(zhuǎn)錄以來，關(guān)于興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)機(jī)制有大量研究。突觸傳遞過程中通過NMDA受體進(jìn)入的Ca²⁺離子和隨后去極化的L型電壓依賴性鈣通道充當(dāng)?shù)诙攀梗瑓⑴c各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活轉(zhuǎn)錄因子以驅(qū)動(dòng)早期基因的轉(zhuǎn)錄。

Fos、arc和egr1（zif268）等傳統(tǒng)IEG已被用作環(huán)境刺激驅(qū)動(dòng)的神經(jīng)元活動(dòng)的替代標(biāo)記，通過原位雜交、免疫染色或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等技術(shù)鑒定最近活躍的神經(jīng)元。這些神經(jīng)元的功能重要性在最近的研究中得到了證明，這些研究利用fos的活性依賴性，在恐懼條件反射期間激活的神經(jīng)元群中表達(dá)基因編碼的光遺傳工具或設(shè)計(jì)藥物受體。隨后對(duì)這些神經(jīng)元群的人工激活足以模擬恐懼反應(yīng) 。

  雖然傳統(tǒng)的IEG在識(shí)別活動(dòng)依賴性回路方面發(fā)揮了重要作用，但這些基因的表達(dá)可能并不適應(yīng)神經(jīng)元活動(dòng)。傳統(tǒng)的IEG轉(zhuǎn)錄是對(duì)突觸活動(dòng)和Ca2+進(jìn)入的反應(yīng)，也是對(duì)生長因子信號(hào)、神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑通過cAMP信號(hào)的反應(yīng)。

Figure 1: Npas4 is a pure marker of neuronal activity.

相比之下，Michael Greenberg的實(shí)驗(yàn)室表明，神經(jīng)元特異性IEG npas4是由神經(jīng)元活動(dòng)強(qiáng)烈而迅速誘導(dǎo)的，但對(duì)旁分泌因子沒有反應(yīng)。這種對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的緊密調(diào)節(jié)表明，Npas4可以成為神經(jīng)元活動(dòng)的更特異的標(biāo)志物。

為了尋找更多對(duì)npas4等活性進(jìn)行純調(diào)節(jié)的基因，我們對(duì)原代培養(yǎng)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行了RNA-Seq實(shí)驗(yàn)，并比較了突觸活性或cAMP驅(qū)動(dòng)的表達(dá)。

Figure 2: Genome-wide demonstration of npas4’s unique tuning to activity.

傳統(tǒng)的IEGs被突觸活性和cAMP上調(diào)。正如預(yù)期的那樣，npas4被突觸活性上調(diào)。事實(shí)上，在檢測(cè)到的所有約15000個(gè)轉(zhuǎn)錄本中，npas4基因是誘導(dǎo)活性最高的，但正如Greenberg實(shí)驗(yàn)室所預(yù)測(cè)的那樣，cAMP不會(huì)上調(diào)npas4。重要的是，沒有發(fā)現(xiàn)任何其他對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)表現(xiàn)出類似調(diào)節(jié)的基因。

為了研究體內(nèi)npas4的誘導(dǎo)，我們進(jìn)行了情境恐懼條件反射（cFC）實(shí)驗(yàn)，并用qPCR和RNA-Seq測(cè)量了海馬和脾后皮質(zhì)（RSC）中的基因表達(dá)，這兩個(gè)腦區(qū)已知與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)。在這些實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物沒有習(xí)慣于恐懼條件反射箱，相對(duì)于小鼠居住籠的反應(yīng)代表了對(duì)編碼模塊，而不是恐懼記憶本身。訓(xùn)練后對(duì)fos、arc和npas4誘導(dǎo)的時(shí)間過程的檢查表明，兩個(gè)腦區(qū)的npas4 mRNA水平在1小時(shí)內(nèi)恢復(fù)到基線水平，而fos和arc表達(dá)在較長時(shí)間內(nèi)保持升高。

這與Yingxi Lin實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)一致，該數(shù)據(jù)顯示，在cFC訓(xùn)練后，這三個(gè)基因的結(jié)果相似。此外，他們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中的急性npas4敲除阻止了fos、arc和zif268/egr1的誘導(dǎo)，這表明npas4是活性依賴性基因誘導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)因子。

為了證明脾后皮質(zhì)中的IEG誘導(dǎo)是由cFC期間NMDA受體的激活誘導(dǎo)的，我們進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，將小鼠暴露于NMDAR拮抗劑MK-801或賦形劑對(duì)照溶液中。重要的是，盡管進(jìn)行了大量的預(yù)處理，但傳統(tǒng)的IEG如arc、fos和egr1在注射后仍增加了表達(dá)，這可能是由于經(jīng)驗(yàn)導(dǎo)致的。

有趣的是，載體注射后npas4沒有增加。所有IEG，包括對(duì)cFC的反應(yīng)，都增加了它們的表達(dá)。用MK-801阻斷NMDAR可以部分阻止傳統(tǒng)IEG表達(dá)的增加，而npas4的增加取決于NMDAR的激活。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明npas4對(duì)載體注射激活的途徑?jīng)]有反應(yīng)。相反，npas4對(duì)cFC有選擇性反應(yīng)，并提供更高保真的突觸活動(dòng)讀數(shù)。

上述數(shù)據(jù)充分表明，傳統(tǒng)IEG對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)本身以外的信號(hào)有反應(yīng)。另一個(gè)類似的發(fā)現(xiàn)來自對(duì)晝夜節(jié)律周期中IEG調(diào)節(jié)的研究。有趣的是，發(fā)現(xiàn)海馬體中傳統(tǒng)IEGs fos和arc的表達(dá)水平具有晝夜節(jié)律，在光暗周期內(nèi)一致波動(dòng)，而npas4轉(zhuǎn)錄水平保持相對(duì)恒定。

這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了除對(duì)環(huán)境線索的急性神經(jīng)元活動(dòng)反應(yīng)之外的因素控制傳統(tǒng)IEG表達(dá)水平的觀點(diǎn)。最后，鑒于npas4相對(duì)于fos和其他傳統(tǒng)IEG的調(diào)節(jié)，以及c-fos非常普遍用于標(biāo)記被認(rèn)為是“記憶痕跡"或“印跡"的活動(dòng)依賴性神經(jīng)元集合的事實(shí)，我們想確定npas4和fos是否標(biāo)記了相同的神經(jīng)元群。為此，我們進(jìn)行了RNAScope原位雜交實(shí)驗(yàn)，觀察cFC后的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本。在海馬體的齒狀回區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)明顯重疊的最近激活的神經(jīng)元群。

然而，在CA1區(qū)，我們看到不同神經(jīng)元群體的跡象可能用兩種不同的基因標(biāo)記。這些數(shù)據(jù)是初步的，不能用于得出明確的結(jié)論，但它們確實(shí)明確提出了僅依靠c-Fos來識(shí)別最近激活的神經(jīng)元系綜的問題，尤其是最近將c-Fos表達(dá)等同于“印跡細(xì)胞"的趨勢(shì)。

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神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白4（Npas4），也稱為Le PAS、NXF、PASD10、bHLHe79，是PER ARNT SIM（bHLH PAS）類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中的一員。Npas4由神經(jīng)元特異性即刻早期基因（IEG）Npas4編碼，該基因受到神經(jīng)元活動(dòng)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。與cfos等傳統(tǒng)IEG不同，npas4對(duì)cAMP或神經(jīng)營養(yǎng)因子等旁分泌因子的刺激沒有反應(yīng)（Lin等人，2008）。此外，Npas4表達(dá)比其他IEG更快速、更短暫（Ramamoorthi等人，2011）。這種對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的緊密調(diào)節(jié)使Npas4成為大腦中神經(jīng)元活動(dòng)的理想標(biāo)志物。

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