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FD 快速高爾基染色試劑盒 GolgiStain TM Kit

更新時間:2018-08-04點擊次數:3921

 

FD Rapid GolgiStainTM Kit FD 快速高爾基染色試劑盒

神經元和膠質細胞形態學研究的完整 Golgi-Cox 染色試劑盒

 

使用手冊中文版

PK401/PK401A

      I.        介紹

Golgi-Cox 浸染法是研究神經元和膠質細胞正常和非正常形態zui有效的方法之一。 使用 Golgi 技術,在藥物處理過的動物腦中和因神經疾病死亡的病人腦中發現了神經 樹突和樹突微小的形態改變。然而 Golgi 染色法的不可靠性且費時已成為這種方法廣泛應用的障礙。

FD Rapid GolgiStainTM Kit(FD 快速高爾基染色法)是根據 Ramón-MolinerGlaser  Van der Loos 所闡述的方法原理設計的。該試劑盒不僅極大地改進并簡化了 Golgi-Cox 技術,而且被證實在顯示神經元和膠質細胞,尤其是樹突棘的形態細節極為靈敏 可靠。北京博蕾德生物代理 FD Rapid GolgiStainTM Kit 已被廣泛用于并用于數種動 物腦組織染色

II.     試劑盒盒組分

 

PK401A

PK401

溶液 A

125 ml

250 ml

溶液 B

125 ml

250 ml

溶液 C

125 ml x 2

250 ml x 2

溶液 D

125 ml

250 ml

溶液 E

125 ml

250 ml

琉璃樣品回收器

2

2

天然毛畫筆

2

2

滴瓶

1

1

塑料鑷子

1

1

使用手冊

1

1


III.  需要但未包括在試劑盒里的物品

1.     雙蒸水或 Milli-Q 

      2.    塑料/玻璃管或瓶

  3.    組織學耗材: 明膠包被的顯微鏡載玻片(Cat.#PO101 蓋玻片

 染色罐 乙醇 二甲苯

樹膠封片劑 Permount®

光學顯微鏡

IV.        安全操作注意事項

1.   FD Rapid GolgiStainTM Kit 僅用于體外研究,不能用于診斷或其它應用。

2. 試劑盒所包含有試劑是有毒的,吸入或接觸皮膚是有害的,如果吞咽可能是致 命的。不要用嘴吸。避免吸入和接觸皮膚和眼睛。如果接觸,立即用大量的水 沖洗并求助醫生。

3. 在化學通風櫥下完成實驗。操作這些試劑時須穿戴合適的防護服,手套和眼睛 和面部防護罩,完成實驗之后把手*沖洗干凈。

V.     組織制備

使用此試劑盒前必須仔細閱讀以下說明?。?/span>

l     所用容器(zui好為塑料材質)必須用蒸餾水沖洗干凈。

l     當溶液 A 和溶液 B 存在時不能使用金屬器具。

l     保持容器密封。

l     用溶液 A 和溶液 B 處理的組織和切片,應該避光。

l     除非特別指出,以下流程需在室溫下完成。

1.    殺死動物之前對實驗動物進行深度麻醉。應盡快地從顱骨中取出動物的腦(或病人的腦),但操作時必須非常小心以免損傷或壓迫組織。

注意

l 除非*必要,不要對動物進行灌注。如果確實需要對動物進行灌注(用4%的多聚甲醛處理不要超過 5 分鐘),一定不要對組織進行后固定處理。

l  體積較大的腦部樣本包括大鼠腦部應該用鋒利的刀片切成大約 10mm 厚的 塊狀。

重要提示!

2.    用雙蒸水或 Milli-Q 水快速沖掉組織表面的血液。

3.    把組織浸泡在由溶液 A  B 等體積混合的浸漬液中,室溫下黑暗保存兩周*。浸  6 個小時以后或次日更換新的浸漬液。

*對于大多數情況浸泡 2 周是足夠的。然而,不同的組織類型及組織的大小不同 可能需要延長或縮短浸泡時間來達到zui佳效果。對于每種類型的組織的浸泡時 間應該通過試驗獲得,但是對于大多數組織浸泡 3 周是足夠的。注意,延長浸 泡時間可能增加染色背景

注意

l  溶液 A 和溶液 B 的混合液至少在用之前 24 小時配制,并不能攪拌。

l   采用以上方案則不會產生沉淀是關鍵的。

l   制備好的浸泡液在用之前室溫黑暗保存可長達一個月。

l    m3 待研究組織至少用 5ml 浸泡液。注意用較少的浸泡液可能降低染色 的靈敏性和可靠性。

l   為取得zui佳結果,在浸泡期間每周兩次對裝有組織的容器可輕輕地左右旋 渦(一定不要晃動!)幾秒鐘溶液 A  B (含有升Hg,重鉻酸鉀和鉻酸鉀)接觸皮膚是有毒的,如果吞 咽可能是致命的。實驗應該在化學通風櫥中完成。當操作這些試劑時應穿 戴防護服,手套和防護面具/眼鏡。不要把溶液  的廢棄物倒進水槽中! 把溶液 A  B 的廢棄物收集起來放到一個瓶子中,致電安全辦公室或有執 照的專業廢物處理服務的部門處理些材料。

4.    轉移組織到溶液 C 中室溫黑暗至少 72 小時(可長達 1 周)。24 小時后或次日至 少更換一次溶液。

5.    -20-22的條件下用冷凍切片機將組織切成 100-200  um 厚的薄片(進行切片之前請仔細閱讀第 4  5 頁的信息)。也可用其它型號的顯微鏡薄片切片機包括滑動切片機和振動切片機(具體細節參看第 4  5 頁)。用樣本回收器(試 劑盒提供)把樣本轉移到含有溶液 C(試劑盒所提供的滴瓶是方便溶液 C 滴到載 玻片上)的明膠包被的顯微鏡載玻片上(Cat#PO101)。載玻片上多余的溶液用 吸管吸走并用濾紙吸干(載玻片上的溶液必須盡可能地吸干否則切片將從載玻 片上脫落下來)。切片可以室溫下自然風干(不能用電風扇或電熱板使其干燥)。 為取得zui佳結果,應盡快地完成切片,制備好的切片如果保存于載玻片盒中, 室溫黑暗條件下zui長可保存 3 天。

注意

l 為避免組織受冷凍切片機的損害,并盡可能地保持細胞形態學,組織在進 行冷凍切片之前應快速冰凍。比如,組織應按以下描述盡可能地快速冰凍: 把組織放在一個塑料匙中慢慢地浸入含有干冰的異戊烷中預冷(為取得zui 佳結果,溫度應保持在-70以下并且浸入過程用時 1 分鐘,越慢越好)。組織*浸入異戊烷之后,使組織在異戊烷中浸幾秒鐘,然后再放置干冰上 1分鐘以確保組織能很好地冰凍。進行切片之前不要讓組織融化。

l 切片機的型號可能會有不同,但所用的型號確保能切厚的切片(比如 100 um)。

l     如果冰凍切片機只有一個溫度設置,那么在進行切片之前把溫度設置在-22 至少 4 個小時。如果有兩個溫度設置,那么設置槽內溫度比樣本溫度低 1。 請注意大多數情況下-22zui佳的溫度,然而,為了更順利地切出切片并 沒有破碎,不同型號的切片機和不同的組織可能需要更高或更低的槽內溫 度。

l 對于用冰凍切片機切片,以下幾點提示是有益的:1)用蒸餾水把組織固定 于樣本盤上,但必須確保組織沒有融化(可以在干冰上完成)。組織可以被 固定在任何類型的組織冰凍介質上包括 OCT,但要避免切斷介質。不要在 OCT 中包埋組織,如果組織確實需要包埋,用 TFM 替代 OCT2)組織固定 到樣本盤后,放置組織于干冰上 10 分鐘,然后立即把固定有樣本的樣本盤安裝到冰凍切片機上,等 5 分鐘之后進行切片。3)切好的一些切片(不要 使用防卷板),如果組織溫度過低比如切片顯示出與刀片平行的裂縫,先等 幾分鐘再進行下一個切片,否則可繼續切。

l  浸泡的腦可用瓊脂糖或明膠包埋然后用冰凍切片機切片。然而收集切片時(充滿切片槽),必須使用溶液 C。否則切片易干燥裂紋。

l  如果用滑動切片機切浸泡的組織,樣本盤和刀片都需維持在較低的溫度(0 以下)按照操作手冊的描述切片固定在含有溶液 C 的載玻片上是重要的。

VI.    染色步驟

在染色過程中和蓋蓋玻片之前的任何一步都不要讓切片變干

1.    用雙蒸水或 Milli-Q 水沖洗切片兩次,每次 4 分鐘。

2.    把切片置于由 1 份溶液 D,1 份溶液 E  2 份的雙蒸水或 Milli-Q 水組成的混合液  10 分鐘。

比如:

溶液 D          10ml

溶液 E     10ml

雙蒸水    20ml

注意

l  工作液zui好現配現用,每 100ml 工作液zui多用于 100 張切片(比如小鼠腦), 根據切片的大小。

l  盛有工作液的瓶子或染色罐必須蓋好蓋子防止試劑蒸發。

l  為取得zui佳結果,孵育期間應頻繁攪拌工作液。

3.    用蒸餾水或 Milli-Q 水沖洗切片兩次,每次 4 分鐘(蒸餾水應頻繁更換新的)。

4.    用結晶紫或硫堇對切片進行復染(可選步驟)。

注意

l  對于復染,延長步驟 3 的時間,比如用沖洗 4 次每次 5 分鐘代替原來的沖洗2 次每次 4 分鐘,或者更長的時間。

5.     50%75% 95%的乙醇中對切片進行脫水,每個濃度梯度脫水 4 分鐘(不要 跳過任何一個步驟)。

6.    然后在無水乙醇中對切片進行脫水,4 次,每次 4 分鐘(不要延長時間)。

7.    在二甲苯中透明,3 次,每次 4 分鐘,并且用樹脂封片劑對蓋玻片進行封片。

注意

l  蓋玻片之前切片可以暫時存于二甲苯中幾個小時。

l  為取得zui佳結果,zui好用未稀釋的封片劑。

l   Golgi 染色的切片無論何時都應避光保存。

 

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